Реферат «Тұрақтылықтың ақуызды инженериясы»

Жаратылыстану жоғары мектебі

Реферат тақырыбы:

«Тұрақтылықтың ақуызды инженериясы»

Дайындаған:

2020ж

Жоспар:

КІРІСПЕ....................................................................................................................3

1. Ақуыз инженериясы............................................................................................4

1.1. Ақуыз инженериясының бағыттары.....................................................4

1.2. Ақуыздардың құрылымдық қасиеттерінің өзгеруі.............................4

1.3. Жаңа жүйелерді құру.............................................................................4

1.4. Фармакология мен медицинада қолдану...... ......................................4

2.Сайтқа бағытталған мутагенез және ақуыздарды құрылымдық функционалды талдау............................................................................................ 6

3. Ақуыздарды компьютерлік модельдеу............................................................10

4. Ақуыздық инженерия әдістері.........................................................................12

4.1 Ақуыз техникасы және биотехнология..............................................13

Қорытынды............................................................................................................15

Пайдаланылған әдебиеттер тізімі........................................................................16

Кіріспе

Ақуыз инженериясы-жаңа сала молекулалық биология және биотехнология-синтетикалық ғылым ретінде пайда болды гендік инженерия, құрылымдық биология және компьютерлік технологияның соңғы жетістіктері. Қалай ақуыз инженериясының негізгі міндеті қолданыстағы құрылымдардың құрылымын өзгертуге бағытталған ақуыздарды жаңа бірегей немесе

бар қасиеттердің өзгеруі [1-3].

Ақуыз инженериясында ақуыз дизайны оның кеңістіктік құрылымының деңгейі оның гендік инженериядан түбегейлі айырмашылығы бар, дегенмен гендік инженерияның эксперименттік әдістері мен тәсілдері ақуыз инженериясы.

Биохимиктер ұзақ уақыт бойы қасиеттерін жақсартуға тырысты табиғи ақуыздар, атап айтқанда ферменттер олардың ерекшелігінің өзгеруі, каталитикалық белсенділік, жұмыс істеу шегі, тұрақтылықты арттыру, оларға жаңа функциялар беру және т. б. Табиғи ферменттер әдетте жұмыс істейді тек белгілі бір температура аралықтарында және физика-химиялық жағдайларда, бұл оларды биотехнологияда қолдануды айтарлықтай шектейді. Ақуыз техникасы бейімделуге мүмкіндік береді ақуыздардың құрылымы және олардың биотехнологиялық процестерге қажетті жағдайларға қасиеттері.

Осылайша, ақуыз техникасы, бір жағынан, ақуыздарды құрылымдық-функционалдық талдаудың қуатты және ақпараттық әдісі болып табылады, ал екінші жағынан, ол ең көп болып табылады қазіргі биотехнологияның алдыңғы қатарлы бағыттары.

1. Ақуыз инженериясы

1.1 Ақуыз инженериясының бағыттары

Қазіргі уақытта ақуыз инженериясының негізгі бағыттары:

1) сайтқа бағытталған әдістермен ақуыздарды құрылымдық-функционалдық талдау жеке аминқышқыл қалдықтарының мутагенезі;

2) химерлік және мультифункционалды

3) кездейсоқ мутагенез және ақуыз селекциясы белгілі бір функциямен (молекулалық эволюция);

4) жасанды ақуыздарды жасау de novo.

Бұл жағдайда ақуыз инженериясы келесі мәселелерді шешеді:

1. Ферменттер ерекшелігінің өзгеруі және олардың

каталитикалық сипаттамалары (Ктах жоғарылауы ,

Кю азайту

рН-оптимумның өзгеруі, ингибирлеу сайтының жойылуы).

2. Ақуыздардың құрылымдық қасиеттерінің өзгеруі

Ақуыздардың құрылымдық қасиеттерінің өзгеруі (жылу тұрақтылығының жоғарылауы, органикалық еріткіштерде тұрақтылықтың жоғарылауы, өзгерістер лигандтарды байланыстыру ерекшелігін өзгерту, ақуыздың молекулааралық динамикасының өзгеруі).

Ақуыз құрылымын жобалау және модельдеу

Сайт спецификалық мутагенез

Рекомбинантты мутантты ДНҚ

Мутантты ақуызды құрылымдық талдау

Мутантты ақуызды функционалдық талдау

Мутантты ақуызды білдіру және тазарту

Ақуыз инженериясындағы зерттеудің жеке кезеңдерінің циклі

3.Жаңа жүйелерді құру

Жаңа жүйелерді құру (химиялық және көп функционалды ақуыздар, репортер домендерін енгізу (GFP), ақуыздарды тазартуға арналған ta^-фрагменттерін енгізу және т. б.)

4. Фармакология мен медицинада қолдану

Фармакология мен медицинада қолдану үшін терапевтік макромолекулалар ретінде ақуыздардың тиімділігін арттыру.

Ақуыз инженериясы гендік инженерияның логикалық дамуы нәтижесінде пайда болды және олигонуклеотидтерді қолдана отырып, гендік модификацияның негізгі принциптерін қалыптастыруға және тиісті технологияларды құруға мүмкіндік берді. Эксперименттік ақуыз инженериясының негізін құрайтын сайт бағытталған мутагенез әдісін Смит және басқалар жасаған. 70-жылдардың соңында [5, 6] және ақуыздардағы белгілі бір амин қышқылдарының қалдықтарын селективті ауыстыруға мүмкіндік берді. Сайт-гендік мутагенез әдістерін жасау және дамыту үшін 1992 жылы Смит Нобель сыйлығына ие болды.

Ақуыз инженериясын зерттеудің жеке кезеңдерінің реттілігі суретте көрсетілген. Бірінші кезеңде ақуыз құрылымын жобалау және модельдеу келесі кезеңде жүзеге асырылады — сайт-мутагенездің спецификалық түрі, мутантты ақуыздың өрнегі және оны тазарту, оның функционалдық және құрылымдық талдауы. Компьютерлік әдістер арқылы ақуыз дизайнының сәттілігі ақуыздарды жою принциптерін түсінуге де, мәліметтер базасынан алынған құрылымдық ақпаратқа да байланысты.

Белокты зерттеудің негізгі кезеңдерінің циклі инженерлік тапсырма орындалғанға дейін қайталанады.

.

2.Сайтқа бағытталған мутагенез және ақуыздарды құрылымдық функционалды талдау.

Сайтқа бағытталған мутагенез әдісімен белгілі бір амин қышқылдарының қалдықтарын мақсатты түрде ауыстыру мүмкіндігі олардың функционалды рөлін зерттеуге мүмкіндік береді. Бұл әдісті рентгендік құрылымдық талдаумен немесе құрылымдық ЯМР спектроскопиясымен бірге қолдану әсіресе тиімді. Мутагенездің осы түрін жүргізу кезінде ген тізбегіндегі белгілі бір нуклеотидтің бағытты өзгеруі жүреді, бұл ақуыздағы тиісті амин қышқылының өзгеруіне әкеледі. Олигонуклеотидті праймер қолданылады, оның тізбегі жоспарланған мутацияны енгізеді, содан кейін оны полимеразды тізбекті реакция (ПТР) немесе ДНҚ матрицалық синтезі кезінде ДНҚ молекуласының құрамына қосады.Сайтқа бағытталған мутагенез әдістерін қолдана отырып, ДНҚ-ға нүктелік алмастыру, кірістіру, жою, инверсия, гендік синтез сияқты мутацияларды енгізуге болады.

Олигонуклеотидті гетеродуплекстерді қолдана отырып, сайтқа бағытталған мутагенез. Бір тізбекті матрицамен будандастырылған мутантты олигонуклеотидті праймерді аяқтауға негізделген ДНҚ полимераза арқылы [5, 6]. Бұл әдісті қолданған кезде мутанттардың шығуы шамамен 50% құрайды. Мутагенездің басқа әдістерінің көпшілігі ПТР-ны қолдануға негізделген, оның артықшылығы өте жоғары, 100% - ға жуық, шығу мутанттары [7, 8].

Жақында сайтқа бағытталған мутагенез процедурасы молекулалық биологияның күнделікті әдістерінің біріне айналды. Бірқатар компаниялар стандартты реагенттер жиынтығын шығарады сайт-бағытталған мутагенез және сонымен бірге 460 ақуыз инженериясы жаңа түпнұсқа әдістерді жасайды. Ең тиімділерінің бірі - "QuikChange" әдісі ("Stratagene", АҚШ). "QuikChange" жүйесінің ерекшелігі-праймерлер өзара толықтырылуы керек. "QuikChange" әдісін қолданған кезде мутанттардың шығуы кемінде 80% құрайды. Бұл жүйе бір нуклеотидті алмастыруларды енгізу үшін ең оңтайлы болып табылады. Stratagene ұсынған тағы бір "ExSite" жүйесі жою және инсерция сияқты мутациялардың түрлерін енгізу үшін оңтайлы, оның тиімділігі кем дегенде 60% құрайды.

Қазіргі уақытта сайтқа бағытталған мутагенез көптеген жүздеген ақуыздарды құрылымдық-функционалдық талдау үшін қолданылады, осы зерттеулердің нәтижелері көптеген шолулар мен монографияларда жинақталған [1-5]. Бұл шолуда ақуыз инженериясын қолдану синтетаз аминоацил-тРНҚ құрылымдық-функционалдық талдауын қарастырумен ғана шектеледі. 1982 жылы ақуыздық инженерия әдістерімен зерттеле бастаған алғашқы ферменттердің бірі Bacillus stearothermophilus термофильді бактериялардан тирозилтрнқ синтетаза болды.

Сайтқа-бактериалды тирозилдің арнайы мутагенезі-синтетазаның тРНҚ. Ақуыз биосинтезінің дорибосомалық кезеңінде синтетаздармен (Арсаз, КФ 6.1.1) тРНҚ ферментативті аминоацилденуі генетикалық ақпаратты жүзеге асыру процесінің негізгі кезеңдерінің бірі болып табылады. Молекулалық механизмдерді анықтау үшін тРНҚ-ның арнайы аминоацилденуін АРСаз-ның құрылымдық-функционалдық ұйымдастырылуын егжей-тегжейлі зерделеу қажет.

В. stearothermophilus синтетазасының белсенді тирозил-тРНҚ орталығының құрылымын зерттеуге сайтқа тән мутагенез және рентгендік құрылымдық талдау әдістерінің тіркесімі арқылы айтарлықтай үлес қосылды [10-21]. Туг-АМР аралық өнімі бар синтетаза кешенінің құрылымын зерттеу ферменттегі CYS35 және Thr51 SH-тобы мен Туг-АМР рибоза сақинасының З ' - гидроксилі арасындағы сутегі байланысының болу мүмкіндігін көрсетті [10]. Cys35-ті Ser және Gly-ге ауыстыру ATR байланысының нашарлауына және каталитикалық тұрақтылықтың төмендеуіне әкелді. Алайда, Thr51-ді Ala-ға ауыстыру арқылы сутегі байланысын алып тастау және бүйірлік тізбектің құрылымын ауыстыру арқылы өзгерту Pro-дағы Thr51 каталитикалық тұрақтылықтың жоғарылауына және тирозин үшін Км-нің төмендеуіне әкелді [11, 12].

Thr51—Pro мутациясы кезінде АТР үшін кш/Км қатынасы тирозиладенилат түзілу реакциясы үшін 8400-ден 208000-ға дейін"1 М"1-ге дейін және амин қышқылының қалдықтарын тРНҚ-ға беру реакциясы үшін 1860-тан 95800-ге дейін"1 М"1-ге дейін өсті [12]. Алынған мәліметтерге сүйене отырып, тирозиннің активтену реакциясының катализ механизмі пентакоординатты аралық қосылыстың түзілуін қамтитыны анықталды, оның фосфат тобы thr40 және His45 бүйір тізбектерімен әрекеттесе алады [13].

Мутантты ферменттердің кинетикалық қасиеттерін зерттеу каталитикалық механизмнің негізгі факторы өтпелі күйді тұрақтандыру екендігі туралы нақты дәлелдер берді [13-16]. Катализдегі рөлі өтпелі кешенді тұрақтандырудан тұратын негізгі топтар-His45 және Thr40, сонымен қатар Tug34, Cys35, His48, Thr51 және Tug169 қалдықтары маңызды функционалды рөл атқарады. Алынған мәліметтер тирозилтрнксинтетазаның В-дан екендігі туралы қорытынды жасауға мүмкіндік берді. stearothermophilus катализде өтпелі кешенді тұрақтандыру механизмін қолданады (нуклеофильді немесе қышқыл негізді катализден айырмашылығы), тұрақтандыру сутегі байланыстарына да, электростатикалық өзара әрекеттесуге де байланысты [13].

Сайтқа тән мутагенездің көмегімен рентгенқұрылымдық талдау үшін қол жетімсіз болып табылған тирозил-тРНҚ синтетазаның жұмыс істеуі туралы бірегей ақпарат алынды. Жұмыста [13] тирозинді активтендіру кезінде өтпелі күй моделі қайта құрылды, соның арқасында lys82, Arg86, Lys230 және Lys233 оң зарядталған қалдықтары бар синтетазаның жылжымалы ілмектерімен өзара әрекеттесулер табылды.

Бұл ілмектер индукцияланған сәйкестік механизміне сәйкес өтпелі күйдегі кешенмен өзара әрекеттеседі. Алайда, тирозиладенилаты бар В.stearothermophilus-тен тирозил-тРНҚ синтетаза кешені үшін рентгендік құрылымға сәйкес, бұл қалдықтар 0,8 нм-ден астам қашықтықта жойылады. Осының негізінде жасалған бактериялық тирозил-тРНҚ ерітіндісінде синтетаза жұмыс істеп тұрған кезде ілмектердің айтарлықтай конформациялық қозғалыстарына ұшырауы мүмкін, олар рентгендік құрылымдық талдау арқылы зерттеу кезінде кристалда анықталмайды.

Әдістермен сайты-бағытталған мутагенез зерттелген және межсубъединичные өзара іс-қимыл димере тирозил-тРНК синтетазы [21]. Орналасқан гидрофобты Phel64-ті ауыстыру ASP және Lys зарядталған қалдықтарына арналған қосалқы бөлшектердің байланыс аймақтары белсенді емес мономерлерге белсенді димердің қайтымды диссоциациясына әкелді [21].

Қызықты деректер алынуы бойынша антикооперативному өзара іс-қимыл субъединиц да тирозилтРНК синтетазе бірі В. stearothermophilus [22 ]. Димер тирозил-тРНК синтетазы болып табылатын мәліметтері бойынша, рентгенді құрылымдық талдау, симметриялы, ерітіндіде асимметричен [22 ].

Сайтқа тән мутагенезді қолдана отырып жүргізілген зерттеулер в.stearothermophilus-тен тирозил-тРНҚ синтетазасының тРНҚ-байланыстырушы орталығының құрылымын зерттеуге айтарлықтай үлес қосты.

Оң зарядталған амин қышқылы қалдықтарының кластері анықталды Arg207-Lys208 бір Суббірліктің N соңғы доменінде тРНҚ акцепторлық сабағымен өзара әрекеттеседі [23].

Оң зарядталған аминқышқылдарының қалдықтарының екі бөлек кластері (Arg368-Arg371 және Arg407 - Arg408-Lys410-Lys411) с-терминалды аймақта тРНК тугтың антикодондық тармағымен өзара әрекеттеседі, ал тРНҚ фермент молекуласына белгілі бір бағытта бекітіледі. [24] жұмысында G-дағы тРНКТ өзара әрекеттесуінің егжей-тегжейлі моделі ұсынылған және тирозил-V. stearothermophilus-тен алынған синтетазалар, рентгендік құрылымдық талдау, сайтқа тән мутагенез және компьютерлік модельдеу деректері негізінде. Модельге сәйкес, THR-196 қалдығы мен кьюозин арасындағы байланыс г-дағы trnkt антикодонының 1-ші күйінде

бұл ерекше емес, ал аденин-76 тРНКТ Lys-82 және Arg-86-мен өзара әрекеттеседі. [24] г-дағы тРНКТ пен тирозил-тРНК синтетаза арасындағы қосымша байланыс ерекше қызығушылық тудырады, ол фермент субстрат кешенінің басталу кезеңінен өтпелі кезеңге өту кезінде пайда болады. Бұл байланыс синтетазаның Lys-151 тирозил-тРНК қалдығы мен Г-дағы тРНК-73 аденині арасында жүзеге асырылады және басқа тРНК-тің G-дағы тРНК синтетазасы бар тирозил-тРНК тану үшін өте маңызды.

Сайтта арнайы мутаген З тирозил - тРНҚ сүтқоректілердің синтетазалары. Цитоплазмалық тирозил-сүтқоректілердің синтетазасының тРНҚ молекулалық салмағы 2 * х 59 кДа гомодимер болып табылады [23]. Әрбір мономер екі негізгі құрылымдық модульден тұрады: MH2 терминалды каталитикалық модуль (синтетаздың"минималды" тирозилтрнқ), ол Россманның нуклеотидті байланыстыратын түйінін интерконнект интерфейсін құрайтын байланыстырушы пептидпен және каталитикалық емес цитокинге ұқсас СООН-терминалды модульмен біріктіреді [24]. Тирозил-тРНҚ-дағы т эукариоттық тРНҚ-ны синтетазамен танудың белсенді орталығының құрылымын және механизмін анықтау мәселесі өте маңызды, өйткені г-дағы т эукариоттық тРНҚ-да прокариоттардағы ұзын жасушалы трнктерге қарағанда қысқа қосымша цикл бар және аминоацилирленбейді

бактериялық ферментом [24 ]. Бұрын селективті химиялық модификация әдістерін қолдана отырып, біз эукариоттық тирозил-тРНҚ синтетазаның белсенді орталығының құрылымын зерттедік [24, 25]. Лизин қалдықтарының маңызды рөлі туралы қорытынды жасалды, ферменттің белсенділігі үшін лизиннің бір ғана қалдығы маңызды.

Мутагенез әдісімен біз тирозил-тРНҚ синтетазаның қосылыс пептидінде локализацияланған лизин қалдықтарының функционалдық рөлін зерттедік [26]. Амин қышқылының алмастырғыштары PC P және мутантты glnl42-Vall53 праймерімен енгізілді . Тирозил-тРНҚ синтетазада мутациялардың екі нұсқасы алынды: Lysl47Tyr және қос Lysl46Asn, Lysl47Tyr. Лизиннің екі қалдығын да, бір Lysl47-ні де алмастыру эукариоттық тирозин-спецификалық тРНҚ-ның аминоацилирлеу реакциясында синтетазаның ферментативті белсенділігінің іс жүзінде толық жоғалуына әкелді [26 ].

Осылайша, ақуыз инженериясының әдістері алғаш рет эукариоттық тирозил-тРНҚ синтетаза тРНҚ аминоацилдену реакциясындағы лизиннің критикалық қалдығы lysl47 қалдығы болып табылатындығы көрсетілген.

Россман түйінінің екі жартысын байланыстыратын синтетаза нуклеотидті байланыстыратын доменнің пептиді-нуклеотидті байланыстыратын Домен. Лизиннің бұл қалдығы 147-бұл ірі қара тирозил-тРНҚ синтетазаның тРНҚ байланыстыратын орталығының ең қызықты құрылымдық элементтерінің бірі, өйткені ол біз бұрын анықтаған бір функционалды маңызды лизин қалдығына сәйкес келеді [25] синтетазаны селективті пиридоксаль-5'-фосфат реагентімен модификациялау тәжірибелерінде. Лизиннің осы жалғыз қалдығын модификациялау кезінде бір жағынан ферменттің белсенділігі толығымен тежелді, ал екінші жағынан синтетазаның екі суббірлігінің өзара әрекеттесуінің антикооперативтілігі көрінді [25]. Бұл қалдық, В. stearothermophilus-тен алынған тирозилтрнк синтетазадағы лизиннің қалдығына сәйкес келуі мүмкін, ол өтпелі күйде G (аденин-73) тРНКТ-мен қосымша байланыс қалыптастыруға қатысады және басқа тРНҚ арасында gnkt-ны тану үшін өте маңызды В.stearothermophilus [16, 17].

Жоғары эукариоттардың синтетазаларының Тирозил-тРНК синтетазаларында қосымша СООН-соңы модулі (с-модуль), гомологиялық цитокин ЕМАР II және сондай-ақ, IN vitro эксперименттерінде цитокиндік белсенділікті көрсетеді [27]. Кейбір гомологиялық домендер сияқты, с Модулінің де жақындығы бар нуклеинды овым қышқылдарға. С-модулін одан әрі құрылымдық-функционалдық талдау үшін гомология бойынша модельдеу әдістерімен оның кеңістіктік құрылымының моделі құрылды [28]. Модельді талдау с-Модуль құрылымында трнктугпен өзара әрекеттесудің әлеуетті сайттарының, сондай-ақ цитокиндік белсенділікке жауапты учаскенің болуын көрсетті. Алынған үш өлшемді с-Модуль құрылымының моделі тирозил-тРНҚ синтетазасының құрылымы мен функцияларының ерекшеліктерін ақуыз инженериясының әдістерімен әрі қарай зерттеуге негіз бола алады. Мысалы, біз ерітіндідегі с-доменнің олигомеризациясының әсерін және фибрилло тәрізді агрегаттардың пайда болуын анықтадық. Сайт - бағытталған мутагенез әдісімен ақуыздың олигомеризациясын болдырмау үшін Tirozil-trna синтетаза с-доменінің Glu479Lys, Asn509Pro және Met511Glu үштік мутанты алынды. Өрнек, таңдау және алынған үш модуль мутантының қасиеттерін зерттеу оның жергілікті доменге тән агрегация тенденциясын көрсетпейтінін көрсетті.

3.Ақуыздарды компьютерлік модельдеу

Ақуыздарды компьютерлік модельдеу, ақуыздарды жобалау әдістерін қолданудың негізгі кезеңдерінің бірі болып табылады. Организмдердің геномдарын реттеудегі маңызды жетістіктер, оның ішінде адам геномының шифрын ашу, компьютерлік құрылымдық биологияның (in silico биологиясы) дамуын ынталандырды [29, 30]. эксперименталды түрде анықталған ақуыз құрылымдарын талдау негізінде эмпирикалық ережелер мен оларды болжау алгоритмдері жасалды белоктардың кеңістіктік құрылымын молекулалық модельдеудің негізі болып табылатын үш өлшемді құрылым. Қазіргі уақытта PDB деректер банкінде 15000-нан астам кеңістіктік құрылымдар бар әр түрлі ақуыздар. Гомологиялық ақуыздың атомдық координаттарын гомологияны модельдеу үшін кеңістіктік матрица ретінде пайдалануға болады. "Компьютерлік мутагенез" көмегімен аминқышқылдарының қалдықтарының бүйірлік радикалдары модельденген ақуыздың қалдықтарымен алмастырылады, олардың құрылымы кейін оңтайландырылады. Құрылымдық модельдің фазалық кеңістігін бағалау үшін эмпирикалық емес, жартылай эмпирикалық және эмпирикалық әдістер қолданылады. Ең жиі қолданылатын эмпирикалық әдістерге күш өрісі әдісі жатады-атомдардың барлық жұптарының өзара әрекеттесу энергиясына арналған аналитикалық функциялары бар макромолекуланы сипаттаудың физикалық моделі. DL I талдау: ақуыздың кеңістіктік құрылымының модельдері және ақуыздың жаңа құрылымының кейінгі дизайны компьютерлік графика әдістерін қолданады.

Ақуыздардың тұрақтылығын арттыру * инженерлік энзимологияда ферменттерді қолдану, әдетте, жоғары температурада биотехнологиялық процестерді жүргізуді қамтиды. Ферменттерді биотехнологиялық процестерде пайдалану үшін олардың термостабельділігі маңызды параметр болып табылады. Қазіргі уақытта ақуыздардың жылу тұрақтылығын арттырудың стандартты тәсілі-белгілі бір негізде s-S байланыстарын енгізу арқылы жылу тұрақты мутанттарды құру ЗБ-құрылымдар. Бұл тәсіл, атап айтқанда, Bacillus circulans ксиланазасы үшін [31 ] сайтқа бағытталған мутагенез әдісімен жаңа S-S байланыстарын енгізу арқылы жүзеге асырылды. Мутациялардың комбинациясы мутантты ксиланаза ақуызын алуға әк