Молекулалық диагностикада қолданылатын әдістерге сипаттама беру.

Әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті

Биология және биотехнология кафедрасы

СӨЖ

Тақырыбы: Молекулалық диагностикада қолданылатын әдістерге

сипаттама беру.

Орындаған: Серғалиқызы Жансая

Тексерген: Тайпақова С.М.

ЖОСПАРЫ

• Кіріспе

• Негізгі бөлім

• Бөлініп алынған ДНҚ молекуласының концентрациясын анықтаудың маңызы

• Агарозды электрофорез әдісіне сипаттама

• Саузерн блот-гибридизация әдісінің маңызы

• Вестерн блот-гибридизация әдісіне қысқаша сипаттама

• Қорытынды

• Пайдаланылған әдебиеттер тізімі

КІРІСПЕ

Соңғы он жылдықтарда молекулалық биологияда бірқатар ашылулардан туындаған ғылыми төңкеріс болды, нәтижесінде ғылыми әлемде жаңа бағыт пайда болды яғни оларға - молекулалық микробиология, молекулалық патология, молекулалық эпидемиология, рекомбинантты ДНҚ немесе ДНҚ технологиясы, тұқым қуалайтын, онкологиялық және жұқпалы аурулардың дамуына тікелей немесе жанама түрде жауап беретін гендерді талдау және оқшаулау мүмкіндігі.

Бұл әдіснаманың мәні нуклеин қышқылдары мен олар кодтайтын ақуыз молекулаларын анықтау және талдау болып табылады. Диагноз қою қиын жұқпалы ауруларды анықтау молекулалық технологияның дамуымен мүмкін болды.

Бұрын қолданылған зертханалық диагностикалық әдістерді қолданудың бірқатар кемшіліктері бар, бірақ аурудың қоздырғышын дәл анықтау нуклеин қышқылдарының ерекше ерекшеліктеріне байланысты оның геномын (ДНҚ немесе РНҚ) анықтау және талдау арқылы ғана мүмкін болады.

Қазіргі уақытта молекулалық диагностикада ПТР, молекулалық будандастыру, жүйелеу, фагоплазмалық типтеу, зерттеу нәтижелеріне классикалық талдау жүргізуге мүмкіндік беретін көптеген биоинформатикалық әдістер, праймерлер дизайны, плазмид векторлары қолданылады.

Молекулалық диагностиканың заманауи әдістерінің негізі американдық ғалым Кери Мюлисс ойлап тапқан полимеразды тізбекті реакция (ПТР) және кез-келген ағзаның ДНҚ-ның кез-келген бөлігін in vitro жағдайында клондауға мүмкіндік береді. 1983 жылы американдық "Science" журналы бұл жаңалықты соңғы жылдардағы ең көрнекті жаңалық деп атады. Птр әзірлегені үшін ғылыми қауымдастық Керри Мю-лиссаға Нобель сыйлығын берді.

Қазіргі уақытта бұл реакция биологияның барлық салаларында кеңінен қолданылады. Жұқпалы аурулардың диагностикасы, - микроорганизмдерді ностика және генотиптеу, олардың вируленттілігін, антибиотиктерге төзімділігін анықтау, пренатальды диагностика, ДНҚ, РНҚ, ақуыз молекулаларын анықтау және талдау, мутацияны, рекомбинацияны болжау және анықтау.

• БӨЛІНІП АЛЫНҒАН ДНҚ МОЛЕКУЛАСЫНЫҢ. КОНЦЕНТРАЦИЯСЫН АНЫҚТАУДЫҢ МАҢЫЗЫ

ДНҚ концентрациясын анықтауға арналған Pico488 бояуы - қос ішекті ДНҚ-ның төмен концентрациясын анықтауға арналған жоғары сезімтал реагент (толқын ұзындығы 260 нм болатын спектрофотометриялық әдіспен анықталмайды). Бояғышты қос ішекті ДНҚ-мен селективті байланыстырудың арқасында өлшеу нәтижелеріне бір ішекті ДНҚ, РНҚ, нуклеотидтер, ақуыздар және басқа қоспалар әсер етпейді. Pico488 бояу құрылымы PicoGreen ® бояу құрылымымен бірдей.

Pico488 бояғышымен ДНҚ концентрациясын өлшеудің сызықтық диапазоны 1 пг/мкл-ден 5 нг/мкл-ге дейін. Қос ішекті ДНҚ молекуласымен байланысқан бояғышта толқын ұзындығы 503 нм болатын максималды сіңу және 525 нм болатын максималды шығарылу бар (флуориметрдің кез-келген түрі өлшеу үшін жарамды). Деректердің дәлдігі мен көбеюі үшін te буферінде ДНҚ үлгілері мен Pico488 бояғыштарын өсіру ұсынылады (10 мм Tris-HCl, pH 7.5, 1 мм EDTA). Зерттелетін ДНҚ концентрациясын есептеу үшін стандартты ДНҚ ерітіндісін сұйылту сериясын қолдана отырып, калибрлеу қисығын құру қажет.

Буфер, стандартты ДНҚ ерітіндісі және Pico488 бояуы Pico488 жиынтығына кіреді. Pico488 бояғышына бөлек тапсырыс беруге болады. Көлемі 1 мл бояғыш ерітінді 2 мл өлшенген үлгінің көлемімен жұмыс істеу кезінде 200 өлшеу жүргізу үшін жеткілікті (көлемі 3.5 мл стандартты флуориметриялық кюветте өлшеу үшін үлгінің ең аз қажетті көлемі). Өлшеу саны үлгінің көлеміне байланысты өзгеруі мүмкін.

1. Pico488 жұмыс ерітіндісін дайындау.

Түтіктің ішіндегісін бояғышпен жібітіп, мұқият араластырыңыз. Барлық үлгілерге (зерттелген үлгілер мен стандартты ДНҚ ерітінділері) жеткілікті мөлшерде бояу ерітіндісін дайындаңыз: бояудың Жұмыс ерітіндісінің көлемі өлшенген үлгінің жалпы көлемінің 50% - ын құрауы керек (төмендегі кестеде пайдаланылған жабдыққа ұсынылған үлгіні көрсетіңіз). Pico488 бояғышының қажетті мөлшерін буфермен 200 есе сұйылтыңыз(TE буферін қолдануды ұсынамыз: 10 мМ this HCl, 1 мМ EDTA, pH 7.5). Араластырыңыз. Ерітінді 3 сағат ішінде қолдануға жарамды.

Мүмкін болатын мөлшерлеу қателерін жою үшін 10-25% маржасы бар бояғыштың жұмыс ерітіндісін дайындауды ұсынамыз. Бояғыштың Жұмыс ерітіндісінің қажетті көлемін есептеу үшін келесі формуланы қолдануға болады:

VPico488 = 5/8 × V қалыбы × (N қалыбы+ N қалыбы), мұндағы V қалыбы — зерттелетін үлгінің немесе Стандарттың өлшенетін көлемі, N қалыбы — өлшенетін үлгілердің саны, және N қалыбы — өлшенетін стандарттардың саны (ДНҚ-ның нөлдік концентрациясы бар үлгіні қоса).

2. Үлгілерді дайындау.

Зерттелетін ДНҚ үлгісін буферде үлгінің көлемі өлшенген көлемнің 50% — ын құрайтындай етіп сұйылтыңыз (үлгінің бастапқы көлемі кез-келген болуы мүмкін, бірақ соңғы сұйылту 1 пг/мкл-5 нг/мкл диапазонына сәйкес келуі керек). Pico488 бояғышының Жұмыс ерітіндісінің тең көлемін қосыңыз. 5 минут араластырыңыз және инкубациялаңыз.

Сол сияқты стандартты ДНҚ ерітіндісін сұйылтуды дайындаңыз. Назар аударыңыз, стандартты ДНҚ ерітіндісінің сұйылтуы тәжірибелік үлгілердің концентрациясының диапазонында болуы керек және жабдықтың сызықтық өлшеу диапазонына сәйкес келетін етіп дайындалуы керек.

3. Флуоресценцияны өлшеу.

Стандартты ДНҚ ерітінділері мен эксперименттік ДНҚ үлгілерінің флуоресценциясының қарқындылығын өлшеңіз(қос ішекті ДНҚ молекуласымен байланысқан бояу толқын ұзындығы 503 нм және максималды эмиссия 525 нм).

4. ДНҚ концентрациясын есептеу.

Стандартты ерітінділердің флуоресценция деңгейі туралы мәліметтерді қолдана отырып, калибрлеу қисығын жасаңыз. Деректерді сызықтық функциямен жақындатыңыз, А және В функциясының параметрлерін табыңыз, флуоресценцияның (FL) концентрацияға тәуелділігінің сызықтық теңдеуі © келесідей:

FL = A × C + B, мұндағы FL-шартты бірліктердегі флуоресценцияның қарқындылығы, ал C — ДНҚ концентрациясы, A және B-сызықтық функцияның параметрлері.

Эксперименттік үлгідегі ДНҚ концентрациясы:

C_үлгі = (FL_үлгі — B)/A, где FL_үлгі мұндағы FL_үлгі — үлгінің флуоресценциясы, A және B — табылған сызықтық функцияның параметрлері.

Бастапқы үлгідегі ДНҚ концентрациясы:

С_{бастапқы} = V_үлгі × C_үлгі/V_{бастапқы}, мұндағы V_үлгі -үлгінің көлемі және V_{бастапқы} - эксперименттік үлгіні дайындау үшін пайдаланылған ДНҚ бастапқы ерітіндісінің көлемі.

Қажетті есептеулерді жүргізу үшін Сіз біздің калькуляторларды пайдалана аласыз: ДНҚ концентрациясын есептеу және ерітінділерді дайындау/сұйылту.

• АГАРОЗДЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ӘДІСІНЕ СИПАТТАМА

Электрофорез (электро-және т. φορέω - "ауыстыру") - мөлшері, молекулалық салмағы, кеңістіктік конфигурациясы, қайталама құрылымы немесе электр заряды бойынша ерекшеленетін макромолекулаларды бөлу әдісі. Алғаш рет 1809 жылы Мәскеу университетінің профессорлары П.И. Страхов және Ф. Ф. Рейс ашты.

Әдіс принципі. Буферлік ерітіндідегі молекулалар электр зарядына ие, олардың мөлшері мен белгісі ортаның рН-на байланысты. Электр тогын ерітінді арқылы өткізген кезде онда бағытталған электр өрісі пайда болады, оның кернеуі электрофорез жүргізілетін ыдыстың ұштары бойынша потенциалдар айырмашылығымен өлшенеді. Өрістің әсерінен молекулалар катод немесе анод бағытында қозғала бастайды. Қозғалыс жылдамдығы зарядтың мөлшеріне, қоршаған ортаның мөлшері мен үйкелісіне байланысты. Уақыт өте келе қоспасы бірдей жылдамдықпен қозғалатын молекулалардан тұратын фракцияларға бөлінеді. Қазіргі тәжірибелерде электрофорез құрылғыларының жұмыс арнасы тор құрылымы бар гельмен толтырылады. Бұл жағдайда молекулалардың қозғалғыштығына және олардың бөліну дәрежесіне олардың сызықтық өлшемдері әсер етеді. Кейбір жағдайларда, әсіресе үлкен молекулалар гельдің тесіктерінен өтпейтін жағдай туындауы мүмкін.

Агарозды гельдегі электрофорез әдісі. Әр түрлі модификациядағы агарозды гель электрофорезі биология мен медицинада нуклеин қышқылдарының, ақуыздардың және басқа макромолекулалардың молекулаларын бөлу үшін кеңінен қолданылады. Су моншасында немесе зертханалық пеште агароза, буфер және су қоспасы ериді. Содан кейін ол 50-60 °C дейін салқындатылып, қалыпқа құйылады. Қолдануға арналған тесіктер тарақпен жасалады. Зерттелетін үлгі диспенсердің көмегімен тесікке қолданылады. Эксперименттің басында тесіктерге салынған бояу гельдің соңына жеткенде, электрофорез тоқтатылады. Содан кейін гель зерттелетін молекулалармен байланысатын бояумен боялған. Бояу жолақтарының түс қарқындылығы үлгідегі молекулалардың концентрациясы туралы түсінік береді. Концентрациядан басқа, электрофорез әдісі зерттелетін молекулалардың салыстырмалы молекулалық массасын анықтауға мүмкіндік береді, ол үшін молекулалық масса маркерлерінің жиынтығы зерттелетін жүйенің молекулалық массаларының диапазонын толығымен жабуы керек.

Бояғыш және буферді таңдау. Бромфенол көк және ксиленцианол-UV астындағы фрагменттерді байқауға айтарлықтай кедергі келтіруі мүмкін. Cresol Red бояуы ферментативті реакциялармен үйлесімді, UV астында байқауға кедергі келтірмейді. OrangeG-бұл ең мобильді бояғыш, әрдайым " жұмыс аймағынан "тыс. UV астында байқалады. Буфердегі бояу тек үлгіні тесік пен гельде оңай байқау үшін қажет.

Агарозды гельдер нуклеин қышқылдарының бөлінуіне байланысты зерттеулерде кеңінен қолданылады.

• Саузерн блот-гибридизация әдісінің маңызы

Саузерн блоттинг (ағылш. Southern blot) – әдісі, ДНҚ-ның үлгідегі белгілі реттілігін анықтау үшін молекулалық биологияда қолданылады.

Саузерн блоттинг әдісі : гибридизация үшін ұзындығы бойынша бөлінген ДНҚ мембранды фильтрге көшіру әдісін ДНҚ ажыратуда агарлы электрофорез әдісімен сипатталады.

Саузерн блот пен басқа көптеген әдістерде радиоактивті емес зондтар қолданысы артуда. Блот байланыспаған зондтардан жуылады да, радиоактивті немесе хемилюминесцентті зонд қолданған жағдайда авторадиография көмегімен суретке түсіріледі. Зонд блотпен байланысқан аудандарда күміс дақтар түзіледі. Хемилюминесцентті зондтар сандық камера көмегімен де байқала алады. Пайда болған жолақтар санына қарап, ген көшірме санын білуге болады. Саузерн блот әдісінің жетілдірілуі норзерн блот (РНҚ молекулаларын ажырату мен блотгау) пен вестерн блот (белоктарды ажырату мен блоттау) әдістерінің негізгі принциптерін қалады. Норзерн мен вестерн блот әдістері әдісті жетілдірген зерттеушілердін аттары «Вестерн» мен «Норзерн» болғандықтан аталмаған; керісінше Эд Саузерннің атына катысты ой ретінде аталған.

Саузерн блотгың көптеген қолданыстары бар, соның ішінде гендерді карталау, гендер топтарын аныктау, генетикалык мутацияларды аныктау, ПТР өнімдерін растау мен ДНҚ фингерпринтингі.

Әдістің жүру сатылары мен әдіс үшін қолданылатын компоненттер:

• Саузерн блоттинг ДНҚ-ның рестриктазалармен кіші фрагменттерге кесілуінен басталады. осының нәтижесінде ұзындығы бойынша әр түрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады.

• ДНҚ фрагменттері агарозды гель-электрофорез көмегімен ажыратылады. мұның нәтижесінде олар агарозалық гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын, ол электр өрісінің әсерінен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осындай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің ұзындығын анықтайды. Бірақ хромосомалык ДНҚ-ны рестрикциялык ферментгерімен өңдеу нэтижесінде пайда болатын фрагменттер саны өте көп болады да, форезді іске асыру мен гелді бояу нәтижесінде накты жолақтарды ажырату мүмкін емес. Өңделген ДНҚ гелде созыңқы жағынды болып көрінеді. Саузерн блот керекті спецификалық фрагменттерді анықтау үшін қолданылады.

• Электрофорезден кейін гел ДНҚ-ны денатурациялау мақсатында сілтімен өңделеді; келешекте ДНҚ фрагменттері нейлонды немесе нитроцеллюлозды мембранаға блоттинг әдісінің комегімен тасымалданады. ДНҚ-ны денатурациялау арқылы жалғыз тізбекті үзінділер алып, оларды нитроцеллюлозалы сүзгіге ауыстыру басталады.Ол үшін электрофорез аяқтала салысымен агарозалық гельді тұздың қанықтырылған ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың үстіне орналастырады. Гельді нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың үстіне бірнеше құрғақ сүзгі қағаздарын салып престейді. Тұз ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына сіңеді, ол үшін ерітінді гельден, онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері ерітіндімен бірге тасымалданады, бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары электрофорез пластинкасындағы орналасу тәртібіне дәлме-дәл келеді.

• ДНҚ-ны жақсы байланыстыру үшін нитроцеллюлозды блот пеште қыздырылады немесе қысқа уақыт УК сәулелерінің астында ұсталады.

Саузерн Блоттинг әдісінің жүруі

• Вестерн блот-гибридизация әдісіне қысқаша сипаттама

Вестерн блотинг (Western blot, протеин иммуноблоты, ағылшынша Western blot ) - сынамадағы нақты ақуыздарды анықтау үшін қолданылатын аналитикалық әдіс . Бірінші сатыда денатуратталған полипептидтерді ұзындығы бойынша (әдетте СДС қатысуымен ) немесе ақуыздың үш өлшемді құрылымы бойынша (табиғи күйінде) бөлу үшін ақуыздардың полиакриламидті гель электрофорезі қолданылады . Содан кейін белоктар нитроцеллюлозаға немесе PVDF мембранасына ауыстырылады, содан кейін берілген ақуызға тән антиденелер көмегімен анықталады.

Вестерн блотинг молекулалық биологияда , биохимияда , генетикада және басқа жаратылыстану пәндерінде қолданылады. Тіндер мен жасушалардағы антидене протеиндерін иммундық бояумен және иммундық-иммундық талдау әдісімен анықтау үшін осыған ұқсас басқа әдістер қолданылады ( EIA, Engl. ELISA ).Вестерн блоттинг әдісінің жүру сатылары:

• Үлгіні дайындау

Үлгіні тұтас ұлпадан немесе жасуша дақылынан алуға болады. Көп жағдайда қатты ұлпаны алдымен араластырғышты (үлгінің үлкен көлемі үшін), гомогенизаторды (кішірек көлемде) немесе ультрадыбыспен қолданады . Бұл жағдайда бактериялар, вирустар және қоршаған ортаның басқа компоненттері де ақуыздардың көзі болып табылады. Жасушалардың лизисі мен ақуыздың еруін жақсарту үшін әр түрлі жуғыш заттарды, тұздарды және буферлерді қолдануға болады . Протеаза және фосфатаза ингибиторлары көбіне үлгілерді өздерінің ферменттері арқылы ыдыратпау үшін қосылады . Тіндерді дайындау көбінесе ақуыздың денатурациясын болдырмау үшін төмен температурада жүргізіледі .

Фильтрация мен центрифугалаудың әртүрлі түрлерін қоса алғанда, биохимиялық және механикалық фракциялау әдістерінің тіркесімдері әр түрлі жасушалық бөлімдер мен органеллаларды бөлу үшін қолданылады.

• Гель электрофорез

Ақуыздар полиакриламидті гель электрофорезімен бөлінеді. Ақуыздарды бөлу изоэлектрлік нүкте (рИ), молекулалық салмақ , электр заряды немесе осы параметрлердің комбинациясы арқылы жүзеге асырылуы мүмкін .

Ақуыз бөлу үшін ең көп таралған әдіс - полиакриламид электрофорез қатысуымен натрий додецилсульфата ( . Engl SDS ) Laemmli сәйкес. SDS ақуыздарды денатурациялайды және оларды денатуратталған күйде ұстайды, дисульфидті байланыстыруды төмендететін агенттер, мысалы, дитиотрейтол және меркаптоэтанол , белоктардың екінші және үшінші құрылымдарын бұзу үшін қолданылады . Денатуратталған полипептидтер электр өрісінде акриламидті гель арқылы анодқа ауысады, ал кіші белоктар тезірек қозғалады және осылайша молекулалық салмаққа сәйкес бөлінеді. Акриламид концентрациясыгельдің ажыратымдылығын анықтайды - акриламидтің концентрациясы неғұрлым жоғары болса, төмен молекулалы салмақтағы ақуыздардың резолюциясы соғұрлым жақсы болады. Акриламидтің төмен концентрациясы жоғары молекулалық ақуыздардың ажыратымдылығын жақсартады. Екі өлшемді электрофорезді де қолдануға болады (2-D) . Бұл жағдайда ақуыздарды бөлу екі бағытта - олардың бірінші бағыттағы изоэлектрлік нүктесіне сәйкес және екіншісіндегі молекулалық салмағына сәйкес жүзеге асырылады. Әдетте, «жолақтардың» біреуі молекулалық салмақ маркерлері үшін (белгілі салмақпен белоктардың қоспалары) қалдырылады. Кернеуді қолданғаннан кейін ақуыздар электр өрісінде әртүрлі жылдамдықпен қозғалады. Ілгерілеу жылдамдығындағы айырмашылықтар - электрофоретикалық қозғалғыштық - белоктардың белдеулерге бөлінуіне әкеледі.

• Мембранаға ауыстыру

Протеиндерді антиденелерді қол жетімді ету үшін және оны кейіннен анықтау үшін гельдің жолағымен бірге нитроцеллюлоза немесе фторид поливинилиденінен жасалған мембранаға ауыстырылды ( ағыл. PVDF ). Мембрана гельдің жоғарғы жағына, ал үстіне фильтр қағаздары салынған. Бүкіл стек трансферлік буферге орналастырылған, ол қағазды қылтамырлар күшімен итеріп, ақуыздарды өзімен бірге алып жүреді. Ақуыздарды берудің тағы бір әдісі электроблотация деп аталады және ақуыздарды гельден мембранаға өткізетін электр тогын қолданады. Ақуыздар өздерінің орналасуын сақтай отырып, гельден мембранаға ауысады. Осы «блоттингтің» нәтижесінде ( ағылш. Blotting- тен алынған)) процесс, ақуыздарды анықтау үшін мембрананың жұқа беткі қабатында ұстайды. Мембрана нұсқаларының екеуі де арнайы емес ақуыздармен байланысу қасиеттеріне байланысты қолданылады. Түптеу ақуыз екі негізделген гидрофобты өзара және электростатикалық мембрананың және ақуыз арасындағы өзара. Нитроцеллюлоза қабығы PVDF-ге қарағанда арзанырақ, бірақ әлдеқайда нәзік және қайта таңбалауға төзімділігі төмен. Ақуыздарды гельден мембранаға тасымалдаудың біркелкілігін және жалпы тиімділігін мембрана бояғыштарын Coomassie blue немесе Ponceau S-ға бояу арқылы тексеруге болады . Кумасси - бұл екеуінің ең көп тарағаны, ал Ponceau S сезімтал және суда ериді, бұл кейінірек мембрананы тазалауға және затбелгі жасауға көмектеседі.

• Блоктау

Ақуыздарды байланыстыру қабілеті үшін мембрананы таңдап алғаннан кейін, антиденелер мен мақсатты белокты таңдап алғаннан кейін, мақсатты ақуызды анықтауға қолданылатын мембрана мен антидене арасындағы өзара әрекеттесуді болдырмайтын шаралар қолданылуы керек (өйткені антидене өзі ақуыз болып табылады). Бейспецификалық байланыстыруды бұғаттау мембрананы сұйылтылған протеин ерітіндісіне орналастыру арқылы жүзеге асырылады - әдетте сиыр сарысуы альбумині немесе майсыз сүт ұнтағы (екеуі де арзан), Tween 20 немесе Triton X-100 сияқты жуғыш заттың аз пайызы бар.... Сұйылтылған ерітіндіден шыққан ақуыз мақсатты ақуыз бекітілмеген барлық жерлерде мембранаға бекітіледі. Демек, антиденелер қосқанда, мембранадағы олардың босай алатын жалғыз кеңістігі - белгілі бір мақсатты белоктардың байланысатын жерлері. Батыс флотының соңғы өніміндегі бұл «шу» таза нәтижелерге және жалған позитивтерді жоюға әкеледі.

• Анықтау

Анықтау процесінде мембрана өзгертілген антиденемен қызығушылық ақуызымен «таңбаланады», ол репортер ферментімен байланысады, ол колориметриялық реакцияға әкеліп, түс береді. Әр түрлі себептерге байланысты анықтау екі кезеңде жүзеге асырылады, дегенмен қазір белгілі бір қосымшалар үшін бір сатылы анықтау әдісі қол жетімді. Антиденелер қожайын класына немесе иммундық жасушалардың дақылына әсер етіп белгілі бір белокпен (немесе оның бір бөлігімен) өндіріледі. Әдетте бұл иммундық жауаптың бөлігі, бірақ мұнда (анализде) жиналған антиденелер белокпен тікелей байланысатын