Микроклональное размножение лекарственных растений: проблемы и перспективы

Абдирасилова Майра Шораевна

Микроклональное размножение лекарственных растений: проблемы и перспективы

Абдирасилова М.Ш., учитель биологии

«Казахстанско-Российская гимназия №38 им. М.В.Ломоносова»

(г. Алматы)

Аннотация. В данной статье рассматриваются основные проблемы и перспективы использования технологии микроклонального размножения лекарственных растений.

Ключевые слова: микроклональное размножение, лекарственные растения, фитогормоны, методы.

Лекарственные виды растений на протяжении многих лет используются в качестве лекарственных средств во многих странах мира, играя таким образом важную роль в системе здравоохранения [1]. Всемирная организация здравоохранения подсчитала, что лекарства на основе растений удовлетворяют потребности мирового населения в области здравоохранения на 80%, являясь сырьем для многих современных препаратов. Так, например, самый популярный анальгетик аспирин был первоначально получен из видов Salix и Spiraea [9].

Большое количество препаратов растительного происхождения получило широкое применение в развитых странах. Около 25% населения Великобритании используют растительные лекарственные средства на различных этапах лечения заболеваний. Причем две трети из 50 тысяч видов лекарственных растений, являющихся сырьем для фармацевтического производства, собираются в дикой природе. Такое бесконтрольное использование природного сырья вызывает сильное беспокойство, связанное с уменьшением биоразнообразия, деградацией среды обитания и даже полным исчезновением некоторых видов растений [2].

Рынок химических соединений растительного происхождения, используемых в фармацевтике, при производстве ароматизаторов, духов и красителей, только за один год превышает объем в несколько миллиардов долларов. Причем, по оценке экспертов, эти цифры будут только расти, достигнув 5 триллионов долларов к 2050 году [1].

Решением проблемы увеличивающегося спроса на растительное сырье является использование технологии культуры растительных тканей. Возможности методов современной клеточной биотехнологии растений открывают весьма заманчивые перспективы. Микроклональное размножение растений предполагает активизацию процесса вегетативного роста и размножения живых, способных к регенерации клеток и тканей в условиях in vitro [10]. С помощью такого типа размножения можно получить большое количество идентичных растений на ограниченной площади и в ограниченный срок, что, несомненно, возможно использовать для увеличения объемов производства лекарственного растительного сырья.

Увеличившееся в последние годы значение вторичных растительных метаболитов привело к повышению коммерческого интереса к вторичному обмену веществ растений, особенно к возможности изменения технологии производства биоактивных растительных добавок с использованием технологии культуры тканей [11]. Разнообразные техники микроклонального размножения in vitro позволяют получать не только многочисленные растительные клоны, но и элиминировать заболевания через использование меристем, длительно сохранять растительные ткани, а также улучшать культуру, используя трансфер нужных генов в клетки растений.

Вследствие того, что характеристики растительных тканей и спектр вторичных метаболитов, выделяемых растительными клетками на разных этапах культивирования, варьируются от вида к виду, стандартизация протоколов для микроклонального размножения невозможна. По этой причине индивидуальная разработка надежных протоколов размножения экономически важных лекарственных растений является очень важным процессом [11].

Источники эксплантов и их стерилизация

Материалы, используемые для размножения культур тканей, известны как экспланты. Успех тканевой культуры во многом зависит от возраста и типа эксплантов, так как не все растения обладают одинаковым свойством тотипотентности. Апикальные меристемы, боковые почки и кончики корней являются основным материалом, используемым в качестве эксплантов для микроклонального размножения. Использование слишком больших эксплантов может привести к контаминации культуры, в то же время использование слишком маленьких тканей меристем демонстрирует слабый рост.

Стерилизация эксплантов - один из основных этапов, необходимых для успешного микроразмножения in vitro. Такие стерилизующие вещества, как кальций гипохлорид, гипохлорид натрия, этанол, хлорид ртути, перекись водорода или нитрат серебра, предназначены для стерилизация эксплантов [6]. Стерилизация используется для уменьшения контаминации и получения оздоровленного материала. Выбор стерилизующего агента зависит от типа экспланта, в особенности от морфологических его характеристик, таких, как твердость или мягкость растительной ткани [5].

Микроорганизмы, сохранившиеся при недостаточной стерилизации, будут размножаться и конкурировать с растущими эксплантами за питательные вещества, выделяя химические вещества, которые могут изменить свойства культуральной среды, например, pH, что, в свою очередь, подавит рост эксплантов или даже вызовет их гибель [4]. Стерилизация лабораторных инструментов осуществляется автоклавированием, промывкой спиртом, нагреванием, облучением, воздействием пламенем или фумигацией [7].

Регенерация и органогенез

Производительность культивируемых тканей растения зависит от выбора исходного материала, состава среды, наличия и комбинации регуляторов роста, факторов окружающей среды.

Прямой органогенез считается наиболее предпочтительным способом микроразмножения клонов, так как позволяет сохранить видоспецифичность растений.

Регенерация и развитие растений регулируются растительными гормонами, причем механизм действия разных фитогормонов различен, поэтому одновременное использование в культуральной среде нескольких фитогормонов обладает большей эффективностью.

При органогенезе апикальная меристема верхушек побега, пазушных почек, кончиков корней и цветочных почек стимулируется к дифференциации и росту, в результате чего получают полноценные растения.

Помимо прямого органогенеза выделяют еще непрямой, при котором формирование морфологических структур осуществляется в каллусной культуре. Каллусом называют неорганизованную массу клеток, обладающую свойством тотипотентности. Использование различных соотношений гормонов в среде позволяет регулировать процесс органогенеза. Так, повышенный уровень цитокининов по сравнению с ауксинами приводит к образованию в каллусной культуре стеблевых почек и побегов. Увеличение концентрации ауксина стимулирует ризогенез (рост корней). А равное соотношение концентраций этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани [8].

Соматический эмбриогенез

Соматический эмбриогенез - важный метод регенерации растений, при котором для процесса дифференциации используют зародышеподобные структуры (соматические эмбриоиды). Индукция роста каллуса in vitro зависит от концентрации факторов роста в среде. Так, в работах [10] было показано, что комбинация 5 мг/л гормона бензиламинопурина (аналог цитокинина) и 80 мг/л гормона дихлорфеноксиуксусной кислоты (аналог ауксина) в среде дает высокий процент индукции каллусообразования, по сравнению с использованием среды без гормонов.

Таким образом, так же как и при органогенезе микропобегов процесс регенерации растений методом соматического эмбриогенеза полностью контролируется соответствующим соотношением фитогормонов в среде.

Акклиматизация и трансфер побегов в почву

Акклиматизация и трансфер регенерантов с развитой корневой системой в почву начинается с извлечения их из агаровой культуральной среды, освобождения от остатков агара и переноса в горшки, содержащие смесь стерилизованной почвы и песка в соотношении 3:1. Для обеспечения повышенной влажности в среде произрастания побегов их накрывают прозрачными полиэтиленовыми мешочками. Через 2 недели после посадки побегов в горшки с почвой мешочки удаляют на 2-3 часа в день для ускорения адаптации побегов к натуральным условиям. Через месяц побеги пересаживают и культивируют в естественных условиях [3].

В целом, процесс акклиматизации и адаптации растеньиц к естественным условиям ex vitro очень важен, так как выживаемость регенерантов во многом зависит именно от этой стадии.

Получение вторичных метаболитов лекарственных растений

Вещества, продуцируемые растениями и не связанные с первостепенными функциями, такими как рост, фотосинтез и размножение, называются вторичными метаболитами. Вторичные метаболиты используются в фармацевтической, агрохимической промышленностях, а также при производстве ароматических и пищевых добавок. Примерами таких веществ растительного происхождения являются терпены, полифенолы, стероиды, алкалоиды и гликозиды [5]. Технологии культуры тканей позволяют получать гораздо больший объем вторичных метаболитов по сравнению с родительскими растениями. Так, за счет использования суспензионных клеточных культур Catharanthus roseus был повышен биосинтез алкалоидов, отмечался максимальный выход карденолидов при культивировании тканей Digitalis lanata, продукция азадирахтина и нимбина культивируемыми побегами и корнями Azadirachta indica также была сравнительно выше по сравнению с растениями, культивируемыми в полевых условиях [11].

Выводы и заключение

Идея размножения растений in vitro и использование культуры растительных тканей для производства высококачественных лекарственных препаратов имеют огромный потенциал. Уже разработаны множество протоколов для микроклонального размножения сотен видов лекарственных растений. Успехи в этой области очень важны: они поспособствуют не только уменьшению себестоимости растительного сырья, но и сохранению диких и экзотических растений от вымирания из-за бесконтрольного их использования.

1. Debnath M., Malik C.P, and Bisen P.S. Micropropagation: a tool for the production of highquality plant-based medicines // Current pharmaceutical biotechnology. 2006. №7 (1). P. 33-49.

2. Goel N., Singh N. and Saini R. Efficient in vitro multiplication of Syrian Rue (Peganum harmala L.) using 6-benzylaminopurine pre-conditioned seedling explants // Nature and Science. 2009. № 7(7). P. 129-134.

3. Hazarika B.N. Acclimatization of tissue-cultured plants // Current Science. 2003. №85 (12). P. 1704-1712.

4. Leifert C. and Waites, W.M. Bacterial growth in plant tissue culture media // Journal of Applied Bacteriology. 1992. №72 (6). P. 460-466.

5. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants a review // Biotechnology advances. 2008. №26 (6). P. 548-560.

6. Mihaljevic I., Dugalic K., Tomas V., Viljevac M., Pranjic A., Cmelik Z., Puskar B., Jurkovic Z. In vitro sterilization procedures for micropropagation of ‘Oblačinska’ sour cherry // Journal of Agricultural Sciences. 2013. №58. P. 117-126.

7. Monge G.G., Gatica, A.M. and Melar M.V. Somatic embryogenesis, plant regeneration and acemannan detection in aloe (Aloe barbadensis Mill.) // Agronomía costarricense: Revista de ciencias agrícolas. 2008. №32 (2). P. 41-52.

8. Patel R.M., Shah R.R. Regeneration of Stevia plant through callus culture // Indian J. Pharm. Sci. 2009. №71. P. 46-50.

9. Pezzuto J. Taxol production in plant cell culture comes of age // Nature Biotechnol. 1996. №14. P. 1083.

10. Saleh A., Fahad Al-Qurainy, Mohammad N., Salim K. Efficient Micropropagation Via Somatic Embryogenesis of Potential Cultivar Sagai of Phoenix dactylifera L. // Pak. J. Bot. 2018. №50(6). P. 2251-2258.

11. Srividya N., Devi B.P and Satyanarayana P. Azadirachtin And Nimbin Content in In Vitro Cultured Shoots and Roots of Azadirachta indica A. // Indian J. Plant Physiol. 1998. №3(2). P. 29-134.